NSD蛋白家族(nuclear receptor binding SET domain proteins)包含三個(gè)成員: NSD1、NSD2(又名MMSET或WHSC1)和NSD3(又名WHSC1L1)?，是與腫瘤發(fā)生相關(guān)的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶，對(duì)維持染色質(zhì)穩(wěn)定和基因表達(dá)調(diào)控具有重要作用[1]。

組蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶（Histone lysine methyltransferases, HKMTases）能夠催化1-3個(gè)甲基轉(zhuǎn)移到組蛋白H3和H4的特定賴氨酸殘基(K3, K9, K20, K27, K36和K79)上，是一類表觀遺傳調(diào)節(jié)酶[1-2]。

組蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶具有十分重要的生物學(xué)功能并且與多種疾病密切相關(guān)。

NSD蛋白家族是較新識(shí)別的一個(gè)組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶家族，在多種疾病, 尤其是在腫瘤中常常表達(dá)異常。

對(duì)NSD蛋白家族的研究不僅有助于進(jìn)一步了解相關(guān)腫瘤的發(fā)病機(jī)制，而且有助于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物與腫瘤治療的新靶點(diǎn)，具有潛在和重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[2]。

一、NSD蛋白家族的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能介紹

1.1 NSD蛋白家族的結(jié)構(gòu)

NSD蛋白家族結(jié)構(gòu)十分相似，都是由幾個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域構(gòu)成（圖1.1）。共同的結(jié)構(gòu)域有SET結(jié)構(gòu)域(suvar, enhancer of zeste, trithorax)、2個(gè)PWWP結(jié)構(gòu)域（脯氨酸-色氨酸-色氨酸-脯氨酸結(jié)構(gòu)域）和5個(gè)PHD結(jié)構(gòu)域（plant homeodomain，植物同源結(jié)構(gòu)域），以及NSD特異性的富含半胱氨酸組氨酸(C5HCH)的基序(圖1.2)。

不同的結(jié)構(gòu)域?yàn)镹ID結(jié)構(gòu)域（NSD1），一個(gè)HMG (high-mobility group) DNA結(jié)合域（NSD2）[3-4]。

圖1.1?NSD蛋白家族結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)示意圖[4]

NSD1、NSD2和NSD3在氨基酸殘基703和1409之間有55%-68%的相同序列。高度保守的催化SET結(jié)構(gòu)域和PHD結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)重組中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

PWWP結(jié)構(gòu)域?qū)SD與甲基化的組蛋白H3和DNA的結(jié)合至關(guān)重要[5-6]，而PHD結(jié)構(gòu)域在NSD與其他甲基化的組蛋白的相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7-8]。

NSD1、NSD2和NSD3蛋白分別有2、3、3個(gè)結(jié)構(gòu)亞型（圖1.2）。以NSD2為例，NSD2是NSD家族中最短的蛋白，具有復(fù)雜的表達(dá)模式。

NSD2有3種亞型：第1種長(zhǎng)型NSD2，由1365個(gè)氨基酸組成。第2種短型NSD2，由647個(gè)氨基酸組成。?第3種RE-IIBP(response element II-binding protein)，由584個(gè)氨基酸組成。

長(zhǎng)型NSD2包含兩個(gè)PWWP結(jié)構(gòu)域、一個(gè)HMG DNA結(jié)合域、四個(gè)PHD結(jié)構(gòu)域、AWS、SET和post-SET結(jié)構(gòu)域。

短型NSD2由一個(gè)PWWP結(jié)構(gòu)域和一個(gè)HMG結(jié)構(gòu)域組成。RE-IIBP由兩個(gè)PHD結(jié)構(gòu)域、一個(gè)PWWP結(jié)構(gòu)域和一個(gè)SET結(jié)構(gòu)域組成，不含HMG結(jié)構(gòu)域[4,30]。

圖1.2?NSD蛋白家族不同亞型蛋白結(jié)構(gòu)示意圖[30]

1.2 NSD蛋白家族的分子生物學(xué)功能

盡管三種NSD蛋白在約700個(gè)氨基酸的模塊內(nèi)具有高度相似性，但它們具有不同的功能，原因在于其SET結(jié)構(gòu)域有不同的底物特異性。

NSD1、NSD2和NSD3介導(dǎo)了不同的致癌機(jī)制。NSD1涉及NSD1-NUP98(核蛋白98)融合、NF-κB通路和CpG(胞嘧啶/磷酸/鳥嘌呤)島啟動(dòng)子高甲基化。NSD2涉及NEK7、

Wnt、NF-κB、γ-H2AX-MDC1通路和EZH2-microRNA-NSD2軸。NSD3則涉及NSD3-NUP98、BRD4-NSD3-CHD8、BRD8-NSD3-MYC的融合和NEK7、CCNG1、Wnt通路。

除了底物的特異性，NSD家族的PHD5-C5HCH模塊識(shí)別組蛋白H3能力的不同，也可能會(huì)募集NSD家族蛋白質(zhì)到基因組不同的位置，從而導(dǎo)致了NSD家族三個(gè)蛋白質(zhì)功能上的多樣性。

二、NSD蛋白家族與腫瘤的關(guān)系和靶向藥物研究進(jìn)展

2.1 NSD蛋白家族與腫瘤的關(guān)系

2.1.1 NSD1與腫瘤的關(guān)系

NSD1功能的喪失是兒童發(fā)育疾病小兒巨腦畸形綜合征(Sotos Syndrome)的 主要致病原因[9]。而在腫瘤中，關(guān)于NSD1的研究主要集中NUP98(nucleoporin-98)-NSD1融合蛋白在急性髓性白血病(AML)中的作用[10-11]。

2.1.2 NSD2與腫瘤的關(guān)系

NSD2的高表達(dá)可以加速腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。在急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)群體中, 存在高達(dá)14%的NSD2 E1099K點(diǎn)突變[13]。臨床病理相關(guān)研究顯示，NSD2蛋白水平在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌?、子宮內(nèi)膜癌和肝癌中高表達(dá)[13-16]。

NSD2蛋白水平在消化道腫瘤(大腸癌、胃癌及肛管癌)、膀胱癌、小細(xì)胞肺癌、女性生殖系統(tǒng)腫瘤和皮膚腫瘤中高表達(dá), 與腫瘤分級(jí)和分期的相關(guān)性有待進(jìn)一步分析[17-18]。

基因研究顯示, NSD2 mRNA在惡性膠質(zhì)瘤、頭頸部腫瘤、肝癌、腎透明細(xì)胞癌、膀胱癌前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌中高表達(dá)，并且與腫瘤的分期正相關(guān)，與頭頸部腫瘤、前列腺癌和膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后相關(guān)[19]。

2.1.3?NSD3與腫瘤的關(guān)系

NSD3 調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞的基因表達(dá)[20]，還可導(dǎo)致肺鱗癌癥[21]。研究表明NSD3在乳腺癌、急性髓性白血病、中線癌、肺癌等多種惡性腫瘤中有促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用，可與NUP98、NUT融合或與BRD4、CHD8、MYC等相互作用，形成致癌復(fù)合物；也可以通過(guò)調(diào)控H3K36me2水平或EGFR（K721）甲基化，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[22-23]。NSD3不僅參與腫瘤的發(fā)生，還與腫瘤的不良預(yù)后及侵襲能力有關(guān)[24]。

2.2 靶向NSD家族蛋白以核小體為底物催化組蛋白甲基化的分子機(jī)制研究

NSD家族蛋白被認(rèn)為是潛在的癌癥靶向藥物治療靶點(diǎn)[25-26]。已知NSD甲基轉(zhuǎn)移酶表現(xiàn)出一種自抑制狀態(tài)，其通過(guò)與核小體結(jié)合而解除自抑制，使組蛋白H3K36位點(diǎn)可以被二甲基化。

然而，這一過(guò)程的分子機(jī)制尚不清楚。

2020年12月23日，南方科技大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)作為第一作者單位，攜手北京師范大學(xué)王占新教授團(tuán)隊(duì)、在Nature雜志在線發(fā)表了題為Molecular basis of nucleosomal H3K36 methylation by NSD methyltransferases的研究論文[27]。

該研究首次報(bào)導(dǎo)了NSD2和NSD3蛋白分別與核小體復(fù)合物的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，NSD2 和NSD3 的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究也為小分子藥物研發(fā)提供了非常有價(jià)值的分子模型，意義十分重大。

同時(shí)揭示了NSD家族蛋白特異性識(shí)別和甲基化組蛋白H3K36的分子機(jī)制，為針對(duì)NSD家族蛋白過(guò)量表達(dá)和突變等引起的多發(fā)性骨髓瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病等靶向治療研究奠定了分子基礎(chǔ)[27]。

該研究利用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)，解析了NSD3、NSD3(E1181K/T1232A)致癌突變體（圖2.1）和NSD2(E1099K/T1150A)致癌突變體分別與核小體結(jié)合復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)[27]。

圖2.1?NSD3(E1181K/T1232A)與核小體復(fù)合物1:1結(jié)合后冷凍電鏡結(jié)構(gòu)電子密度圖[27]

研究人員發(fā)現(xiàn)，NSD2/NSD3與核小體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致核小體出口處連接區(qū)域 (linker region) DNA打開，從而使NSD2/NSD3的催化結(jié)構(gòu)域插入到打開的DNA片段與組蛋白八聚體之間（圖2.2a）。

NSD2/NSD3蛋白多個(gè)帶正電氨基酸與核小體SHL-7、SHL0位置處DNA磷酸骨架相互作用，將NSD2/NSD3穩(wěn)定在核小體上（圖2.2b、d）。

與此同時(shí)，NSD2/NSD3與組蛋白H3的N端α螺旋、H2A的C末端有多個(gè)相互作用位點(diǎn)。

研究人員根據(jù)NSD3與核小體復(fù)合物結(jié)構(gòu)信息設(shè)計(jì)了一系列突變體（圖2.2e、f），發(fā)現(xiàn)NSD3蛋白的催化活性均不同程度降低[27]（圖2.2c）。

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圖2.2 NSD3與核小體的相互作用和突變體對(duì)其活性的影響[30]

通過(guò)對(duì)比NSD2(E1099K/T1150A)與NSD3(E1181K/T1232A)核小體復(fù)合物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)（圖2.3g），NSD2中的致癌突變位點(diǎn)E1099K，即帶負(fù)電氨基酸E1099突變成帶正電氨基酸K1099后，NSD2與核小體之間的靜電作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致了NSD2活性增強(qiáng)（圖2.3h）。

NSD3致癌突變位點(diǎn)?T1232A，當(dāng)蘇氨酸T突變成丙氨酸A，導(dǎo)致H3尾部向A1232位點(diǎn)靠近，形成了一對(duì)新的氫鍵，使H3K36更容易進(jìn)入催化口袋，從而導(dǎo)致酶活性增強(qiáng)（圖2.3i）。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些致癌突變不僅增強(qiáng)了體外催化活性，而且促進(jìn)了癌細(xì)胞增殖以及異種移植瘤生長(zhǎng)[27]（圖2.4d、e、f）。

圖2.3 NSD2、NSD3致癌突變位點(diǎn)與核小體之間的相互作用[27]

圖2.4 NSD2（e、f）和NSD3（d）致癌突變對(duì)其活性和癌細(xì)胞增殖的影響[27]

以人骨肉瘤細(xì)胞U2OS作為研究對(duì)象，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和免疫印跡分析表明野生型和活性增強(qiáng)的突變型（E1181K、T1232A）NSD3會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)移植瘤在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。

其中，癌細(xì)胞的增殖及移植瘤的增長(zhǎng)速率與NSD活性增強(qiáng)突變蛋白的活性正相關(guān)。作為對(duì)照，減弱NSD蛋白催化活性的突變型（L1119A、Y1121A）則不會(huì)引起癌細(xì)胞的增殖和移植瘤在裸鼠體內(nèi)的增長(zhǎng)（圖2.5）[27]。

圖2.5 NSD2（a、b）和NSD3（c、d、e、f）活性增強(qiáng)和減弱的突變對(duì)

癌細(xì)胞增殖影響的WB分析[27]

該研究首次揭示了NSD家族蛋白以核小體為底物催化組蛋白甲基化的分子機(jī)制，以及其癌癥相關(guān)突變可能致病的分子機(jī)理，同時(shí)闡明了NSD蛋白中重要的致癌突變位點(diǎn)活性增強(qiáng)的分子激活機(jī)理。

NSD家族蛋白的過(guò)表達(dá)以及突變均會(huì)導(dǎo)致癌癥發(fā)生，為進(jìn)一步理解NSD家族蛋白的生理功能以及靶向NSD家族蛋白的藥物研發(fā)提供重要分子基礎(chǔ)。同時(shí)指出，H3K36甲基化是癌癥表觀遺傳失調(diào)的一個(gè)重點(diǎn)[27]。

2.2 靶向?NSD 蛋白家族結(jié)構(gòu)域抗腫瘤藥物研究進(jìn)展

盡管許多研究證明了NSD1、NSD2、NSD3在各種癌癥中的生物學(xué)功能，但由于生物分析方法和NSD抑制活性驗(yàn)證的諸多困難，以至于過(guò)去對(duì)NSD抑制劑的報(bào)道較少。

此外，由于所有NSD甲基轉(zhuǎn)移酶的SET結(jié)構(gòu)域都存在一個(gè)獨(dú)特的自抑制環(huán)，使其底物結(jié)合位點(diǎn)難以靠近， 選擇性的有效NSD抑制劑開發(fā)工作因此受阻[28]。

同時(shí)，合成的小肽底物并不能激活 NSD 家族蛋白的催化活性，只有核小體底物存在時(shí)，NSD蛋白才能被激活，并特異催化核小體?H3K36 位點(diǎn)的二甲基化修飾[29]。?

但是 NSD 蛋白對(duì)核小體底物的傾向性以及激活的分子機(jī)制并不清楚。抑制NSD活性開始成為重要的抗腫瘤潛在靶點(diǎn)，開發(fā)靶向NSD家族蛋白的小分子抑制劑已經(jīng)成為藥物研發(fā)的重要方向之一。

隨著靶向NSD家族蛋白以核小體為底物催化組蛋白甲基化的分子機(jī)制研究逐漸成熟[27]，開發(fā)靶向催化SET、PHD和PWWP結(jié)構(gòu)域的小分子NSD抑制劑的研究也取得了新進(jìn)展。

2.2.1靶向催化NSD-SET結(jié)構(gòu)域小分子抑制劑研究進(jìn)展

SET結(jié)構(gòu)域的一端通過(guò)一個(gè)N端的αA螺旋插入到β-片層1旁邊，而另一端則通過(guò)AWS結(jié)構(gòu)域（pre-SET）插入到β-片層3旁邊。S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)分子作為甲基供體，結(jié)合在SET和post-SET結(jié)構(gòu)域之間。賴氨酸底物結(jié)合通道被一個(gè)26個(gè)氨基酸殘基組成的，連接SET和post-SET結(jié)構(gòu)域的短規(guī)則loop阻斷。

該loop(也稱post-SET自抑制環(huán))可以采用一種合適的構(gòu)象以阻止H3K36接近SAM，這種自抑制構(gòu)象能夠阻止組蛋白賴氨酸底物進(jìn)入活性位點(diǎn)[27,30]（圖2.6）。

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圖2.6 post-SET自抑制環(huán)形成原理和結(jié)構(gòu)示意圖[27]

研究人員利用高通量篩選方法發(fā)現(xiàn)了DA3003-1(13)，PF-03882845(14)，TCLPA54(15)和ABT199(16)。

體外實(shí)驗(yàn)表明它們可與催化SET結(jié)構(gòu)域結(jié)合而發(fā)揮對(duì)NSD2的抑制作用，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)以上化合物對(duì)NSD1，NSD2，NSD3的抑制IC50為0.06-12μM。

此外，在人骨肉瘤細(xì)胞U2OS中，DA3003-1(13)和PF-03882845(14)也表現(xiàn)出對(duì)NSD2的抑制作用（圖2.7）[30]。

圖2.7 靶向NSD-SET結(jié)構(gòu)域小分子抑制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)式（13、14、15、16）[30]

Post-SET結(jié)構(gòu)域的自抑制環(huán)通過(guò)構(gòu)象變化形成獨(dú)特的通道狀口袋以結(jié)合小分子。基于這種構(gòu)象變化的關(guān)系的設(shè)計(jì)合成了甲基-氮雜環(huán)丙烷化合物25

(BT5)，其對(duì)NSD1的抑制IC50=5.8μM明顯增強(qiáng)，同時(shí)具有NSD2和NSD3的抑制IC50分別為26.7μM和14.3μM。

細(xì)胞分析表明，化合物25可選擇性地結(jié)合HEK293細(xì)胞的NSD1-SET結(jié)構(gòu)域。機(jī)制研究表明，化合物25降低NUP98-NSD1靶基因HOXA9和MEIS1的表達(dá)，并通過(guò)削弱白血病細(xì)胞NUP98-NSD1活性而降低H3K36me2整體水平[30]（圖2.8）。

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圖2.8 靶向NSD-SET結(jié)構(gòu)域小分子抑制劑（BT5）[30]

2.2.2靶向NSD-PHD結(jié)構(gòu)域小分子抑制劑的研究進(jìn)展

NSD蛋白的PHD結(jié)構(gòu)域是開發(fā)小分子NSD抑制劑的重要靶向位點(diǎn)。米托蒽酮二鹽酸鹽(26, 拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑)、奎納克林二鹽酸鹽(27,抗瘧藥物的吖啶類似物)和氯喹二磷酸鹽(28, 抗瘧藥物)作為靶向NSD1-PHD的先導(dǎo)分子，這些化合物能夠結(jié)合PHDVC5HCH，從而減少與鋅指結(jié)構(gòu)域的相互作用（圖2.9）[30]。

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圖2.9 靶向NSD-PHD結(jié)構(gòu)域先導(dǎo)分子化學(xué)結(jié)構(gòu)式及其作用原理（26、27、28）[30]

2.2.3靶向NSD-PWWP結(jié)構(gòu)域小分子抑制劑的研究進(jìn)展

NSD蛋白的PWWP結(jié)構(gòu)域在NSD甲基轉(zhuǎn)移酶活性中具有關(guān)鍵作用，因此，利用小分子干擾PWWP結(jié)構(gòu)域的功能是抑制NSD活性的策略之一。

以靶向NSD3-PWWP1結(jié)構(gòu)域的小分子為例，首先，研究人員從1899種化合物中鑒定出先導(dǎo)片段35和36（圖2.10A）。共晶結(jié)構(gòu)表明35和36能與NSD3-PWWP1結(jié)構(gòu)域的芳香性籠狀結(jié)構(gòu)中的Tyr281、Trp284和Phe312殘基相互作用，35的吡唑環(huán)和36的甲基二氫噠嗪環(huán)與Tyr281和Phe312存在π-π相互作用。

同樣，35的吡啶環(huán)和36的苯環(huán)很好地適應(yīng)Trp284形成的親脂平面，另外，35吡啶取代基的氮原子與Ser314形成氫鍵，36哌啶環(huán)的氮原子與Glu318形成氫鍵（圖2.10B）。

基于片段的篩選發(fā)現(xiàn)了小分子化學(xué)探針BI-9321(37)?（圖2.10A），是NSD3-PWWP1結(jié)構(gòu)域的選擇性和強(qiáng)效的拮抗劑（圖2.10C）。為設(shè)計(jì)和合成NSD靶向的強(qiáng)選擇性抗癌藥物小分子提供思路?[30]。

圖2.10 靶向NSD3-PWWP1結(jié)構(gòu)域先導(dǎo)分子化學(xué)結(jié)構(gòu)式及其作用原理（35、36、37）[30]