在他山之石系列文章-1中，鼎泰集團對第1款 siRNA 藥物 Patisiran（Onpattro?）的上市歷程及臨床開發(fā)路徑進行了復盤分析（點擊查看原文），為我們清晰、全面地呈現了一款 siRNA 藥物如何從非臨床向臨床轉化，以及借助無縫銜接的臨床研發(fā)策略在 IND 后的短短 6 年內獲批上市的經典案例。
在他山之石系列文章-2中，在對第2款已上市siRNA 藥物 — Givosiran（Givlaari?） 的上市歷程及臨床開發(fā)路徑進行復盤分析的同時，增加了更多與臨床轉化有關的內容，以期為指導 siRNA 藥物的非臨床研究、運用臨床前研究結果支持臨床開發(fā)，以及全局視角的研發(fā)策略的制定提供參考和啟發(fā)。
推文發(fā)出后，很多熱心專家和老師在后臺積極互動，并提出了許多寶貴的意見和建議，這激勵我們團隊有必要對前期內容進行進一步的補充和改進。在此，鼎泰團隊特別感謝關注我們成長和努力的朋友們和老師們。
本次更新的內容主要包括：進一步細化了FIH 起始劑量的設計依據，補充了代謝產物評估以及藥代動力學和免疫原性檢測相關的內容。
Givosiran是由 Alnylam Pharmaceuticals 開發(fā)的首個 GalNAc 偶聯(lián)的 siRNA 藥物（GalNac-siRNA），能夠特異性遞送至肝臟細胞并靶向降解編碼ALAS1蛋白的 mRNA，從而降低神經毒性前體 δ -氨基乙酰丙酸（ALA）和膽色素原（PBG）的水平，減少疾病發(fā)作[1]。
2015年8月13日，Givosiran 向FDA提交了首個IND申請。2019年11月20日，在提交NDA申請后的不足4個月（比預期的PUDUFA時間提前了近3個月）內即獲得FDA批準用于治療成人急性肝卟啉癥（AHP）。然后分別于2020年3月2日和2021年6月23日獲得 EMA 和 PMDA 批準上市。該適應癥的批準是基于關鍵性III 期臨床試驗（NCT03338816，代號ENVISION）的積極結果。Givosiran的成功上市不僅為AHP患者帶來了新的治療選擇，也為RNAi技術在治療罕見疾病領域的應用提供了新的范例。
AHP 是由于血紅素生物合成途徑中第3個[表現為急性間歇性肝卟啉癥（AIP）]、第6個[家族性卟啉原卟啉酸尿癥（HCP）]或第7個[變異卟啉病（VP）]酶的常染色體顯性失活，或在非常罕見的情況下，由常染色體隱性遺傳導致的一種罕見、嚴重、可能危及生命的遺傳性疾病。這些染色體的異常變化導致 ALA 和 PBG 的積累，進而導致急性卟啉癥發(fā)作，主要表現為腦脊髓與交感神經系統(tǒng)的癥狀，如腹痛（主要癥狀）、急性神經病變等。大多數有癥狀的患者在其一生中很少發(fā)作，然而，也有8 %的患者會出現病情加重，反復發(fā)作（≥ 4次/年）。最常見的急性肝卟啉癥是 AIP，其患病率估計為5.4 /百萬人。靜脈注射血紅素是當時歐盟和美國推薦的用于 AHP 急性發(fā)作的治療方案。然而，使用血紅素治療還有諸多限制，除了在水溶液中不穩(wěn)定外，還包括重復給藥可能引起的潛在毒性，如靜脈血栓性靜脈炎、速效耐藥性、凝血異常和繼發(fā)性鐵負荷等。因此，迫切需要更加安全、有效的治療方案來應對急性肝卟啉癥的發(fā)作并減少長期并發(fā)癥。
無縫銜接、駕輕就熟的臨床開發(fā)路徑是 Givosiran 成功上市的重要支撐。1項I期劑量/給藥頻率探索試驗、1項無縫銜接的I/II 期開放標簽擴展（OLE）試驗和1項III期關鍵性臨床試驗為 Givosiran 的NDA申請和獲批上市提供了充分的臨床數據支持。
Ⅰ 期臨床試驗
（NCT02452372，跨地區(qū)多中心）
2015年，Givosiran 的首次人體試驗（FIH）啟動。這是1項多中心、隨機、安慰劑對照的劑量遞增試驗，旨在評估 Givosiran 在 AIP 患者中的安全性、耐受性及藥代動力學/藥效動力學特征。
Ⅰ 期試驗臨床試驗設計
試驗分3部分進行，共入組了40人，均為皮下注射給藥：
A和B部分共入組23人。其中，A部分（SAD；0.035、0.10、0.35、1.0、2.5 mg/kg，42天）和B部分（MAD；QM，0.35、1.0 mg/kg，70天）為單盲試驗，受試者為尿ALA和PBG水平升高但近期未發(fā)作（定義為在給藥前6個月內沒有發(fā)作）的 AIP 患者
C部分（2.5、5.0 mg/kg，Q3M或QM）入組17人，采用雙盲設計，受試者為反復發(fā)作的 AIP 患者
主要終點為給藥后發(fā)生 AEs、SAEs及中斷用藥的受試者比例；次要終點為 Givosiran 藥代動力學參數（Cmax、tmax、t1/2、AUC）以及對尿中ALA和PBG水平的影響。起始劑量設計是從非臨床研究向臨床轉化的第一步。本試驗中起始劑量主要依據：◆ 非臨床藥效學數據（點擊查看往期內容）：
（1）大鼠AIP模型中，Givosiran 以0.3、1或3 mg/kg（QW*4）皮下注射給藥后，可劑量依賴性降低 ALAS1 mRNA 水平，同時伴隨著尿液中 ALA 和 PBG 水平的下降；
（2）小鼠AIP模型中，Givosiran 在 1 mg/kg 劑量下，血清 ALA 和 PBG 水平分別降低80% 和 68%；
（3）食蟹猴模型中，Givosiran 以1 mg/kg 皮下注射給藥后，ALAS1 mRNA 水平僅降低20%。根據申請人前期開發(fā)的產品Revusiran（ALN-TTRSC siRNA）的經驗，從NHP到人按1:1 進行劑量外推，認為0.10 mg/kg 為Givosiran無藥理活性劑量。
◆ 非臨床毒理學數據：
根據大鼠和食蟹猴重復給藥毒理學試驗中確定的 NOAEL 計算安全系數，最終采信了相對保守的基于 BSA 估算的安全系數。基于以上非臨床研究結果，申請人在最初的臨床方案中確定的FIH 起始劑量為 0.10 mg/kg。在完成0.10 和 0.35 mg/kg 劑量組的入組后，增加了更低的0.035 mg/kg 劑量，筆者尚未查到具體原因。如有專家有相關信息，敬請不吝指正。研究結果顯示，對反復發(fā)作的 AIP 患者，經 QM 給藥后的主要AEs均為輕度 AEs；可降低 ALAS1 mRNA 水平，ALA和PBG的水平接近正常，發(fā)作率低于安慰劑組[2]。采用經驗證的 LC-MS/MS 方法檢測了血漿中 Givosiran（詳細的方法學內容詳見后文）。0.035 和 0.1 mg/kg 劑量組血漿中 Givosiran 濃度均低于定量下限；0.35~5.0 mg/kg劑量范圍內，Givosiran 呈線性藥代動力學特征，Tmax為0.5~5 h，24 h 內血漿濃度迅速下降，t1/2為4~10 h。◆ 代謝產物安全性評估：
對于siRNA藥物的代謝產物是否需要進行檢測，以及如何評估代謝產物的安全性一直是業(yè)界思考和關注的問題。本文著重對Givosiran及其代謝產物的非臨床和臨床研究結果進行了分析，或許能為寡核苷酸藥物代謝產物的評價提供一定的參考。AS 3′( N-1 )是Givosiran主要的代謝物（>總物質的10%），在血漿中迅速形成，臨床結果顯示AS 3′( N-1) tmax為1-8 h，t1/2 與 Givosiran 相當，在人體內具有一定的暴露水平。通過與重復給藥 13 周毒性試驗中暴露量的比較發(fā)現，NOAEL劑量下AS 3′( N-1)的暴露量遠高于臨床有效劑量下的暴露量，因此未開展額外的代謝產物研究。
Ⅰ 期試驗安全性和藥代動力學（含代謝產物檢測）研究結果
2016年，啟動了 Ⅰ/Ⅱ 期臨床試驗。這是1項多中心、開放標簽擴展（OLE）研究，旨在評估皮下注射 Givosiran 的長期安全性和臨床活性，受試者為16名已完成前述I期臨床試驗（NCT02452372）C部分的 AIP 患者。主要終點為截至 49 個月時的 AEs 發(fā)生率；次要終點為截至 48 個月時尿液中 ALA 和 PBG 水平的變化、卟啉病發(fā)作的頻率和特點以及截至 49 個月時血紅素給藥情況的變化。
該試驗給藥劑量為2.5 mg/kg，QM皮下注射。根據 Ⅰ 期臨床試驗結果，Givosiran 2.5 mg/kg 單次給藥耐受性良好，但沒有完全使 ALA 和 PBG 水平正?；?；Givosiran 2.5 mg/kg Q3M給藥顯示一定的臨床活性，但部分患者在治療期間仍持續(xù)出現嚴重卟啉病發(fā)作，這提示需要更高的給藥劑量。研究結果顯示，Givosiran 2.5 mg/kg 安全性良好，大多數AEs為輕度至中度；長期使用 Givosiran 使 ALA 和 PBG 水平持續(xù)降低，沒有卟啉癥發(fā)作和不需要使用血紅素的患者比例隨著時間推移增加；安全性和有效性結果與下文所述的 Ⅲ 期臨床試驗（ENVISION）的結果一致[3]。
Ⅲ 期臨床試驗
（NCT03338816，代號ENVISION）
2017年，1項隨機、雙盲、安慰劑對照的6個月多中心 Ⅲ 期臨床試驗啟動（雙盲期后進行30個月開放標簽擴展試驗）。該研究共完成36個月的數據分析，旨在評估 Givosiran 治療急性肝卟啉病患者的療效和安全性，受試者共94人。ENVISION 試驗在18個國家/地區(qū)的36個研究地點進行研究，是AHP進行的最大規(guī)模的治療研究。
ENVISION試驗中給藥劑量為 2.5 mg/kg（QM），劑量設計主要基于對前期試驗結果的考量：相較于 Q3M，QM 給藥使尿中 ALA 的降低程度更高且持續(xù)時間更長，且該降低與卟啉病發(fā)作、血紅素使用和無發(fā)作間隔的顯著減少相關聯(lián)。主要終點為需要住院、緊急醫(yī)療就診或在家接受靜脈血紅素治療的卟啉病發(fā)作的年化發(fā)作率（AAR）；次要終點為3、6個月時尿ALA水平，6個月時尿PBG水平、血紅素使用的比例、簡明疼痛量表（BPI-SF）及 SF-12 健康調查量表等。ENVISION試驗獲得了支持Givosiran用于AHP治療的有效性證據[4]：
ENVISION試驗有效性研究結果
除了成功的臨床開發(fā)計劃外，Givosiran 驚人的上市歷程還受益于與監(jiān)管機構的有效溝通。基于Ⅰ期臨床試驗結果，Alnylam 于2017年6月14日申請召開 Pre-Phase 3會議（此時I/II 期 OLE 試驗已啟動），主要就擬開展的 Ⅲ 期試驗設計征求 FDA 的建議。FDA 認為申請人提出的劑量設計以及主要/次要終點是合理的，建議考慮將接受 Givosiran 治療的 AHP 患者的患者報告結局（Patient Reported Outcomes，PRO）的改善作為一個關鍵終點。通過本次溝通交流獲得的建議，使ENVISION 試驗的有效性結果更快地獲得了FDA的認可。
此外，在從IND和NDA的過程中，還有一系列其他的監(jiān)管互動，如ODD、BTD、B類會議、優(yōu)先審評等。
pre-NDA 會議中，FDA 問及免疫原性對暴露、療效和安全性的影響，可見FDA對siRNA藥物免疫原性的關注。通過對臨床試驗中ADA及藥代檢測方法的梳理，可更好地指導非臨床研究中生物分析工作的開展，并提高其臨床轉化價值。與所有寡核苷酸類藥物一樣，Givosiran 給藥可能存在免疫原性，在上述臨床試驗中，ADA作為探索性試驗終點進行檢測：通過經驗證的ELISA法，其血清中最低檢出濃度（靈敏度）為 37.4 ng/mL，最小要求稀釋倍數（MRD）為50倍。臨床結果顯示，Givosiran 經皮下注射給藥后，ADA陽性率較低，如 Ⅲ 期 DB 階段安慰劑組和Givosiran 組 ADA 陽性率分別有 1/46和 2/48患者在基線時檢測到 ADA 陽性（滴度≤100）；DB 和 OLE 階段，Givosiran 組有1/94患者產生新的 ADA，抗體滴度低且呈一過性，隨后檢測均為陰性。ADA 的發(fā)生對 Givosiran 的 PK，PD 沒有影響；對Givosiran 及其代謝產物的濃度未見影響。以上結果提示，Givosiran具有非常低的引發(fā)免疫反應的風險。同時對藥代生物分析進行梳理，通過經驗證的LC-MS/HRAM、LC-MS/MS法，其血漿中最低檢出濃度為 10、20 ng/mL，其尿液中最低檢出濃度為 50 ng/mL，評估 Givosiran 及其代謝產物的濃度。檢測時間點與 ADA 檢測時間點幾乎一致。
免疫原性檢測方法學和檢測結果
藥代動力學檢測方法學主要參數
在非臨床藥效學研究中，對于Givosiran作用機制相關的藥效學 Biomarker 的變化規(guī)律進行了探索，這些研究不但支持了FIH起始劑量的設計，也為臨床試驗中藥效動力學檢測指標和監(jiān)測時間的確立提供了依據。采用嚙齒類和非人靈長類動物模型進行的AHP非臨床研究中：以0.3、1或3 mg/kg（QW*4）劑量大鼠AIP模型皮下給藥后，與單次給藥類似，對 ALAS1 mRNA 的抑制具有劑量依賴性，同時伴隨著尿液中ALA和PBG水平的相應下降；
以 2.5、5 mg/kg（QW*8）劑量食蟹猴皮下注射 Givosiran 后，血清中 ALAS1 mRNA 水平最大減少約 80%。這些試驗不但考察了 Givosiran 用于AHP治療的作用機制，也為臨床試驗中合理的可用于監(jiān)測和提示預期療效的Biomarker的確立提供了參考。
依賴于對 Givosiran 作用機制的理解以及非臨床研究結果，在I期、I/II臨床OLE期和 III期臨床試驗中均考察了給藥后ALAS1 mRNA、ALA及PBG水平等藥效學標志物的變化，并將其作為劑量和給藥頻率選擇的依據。結果顯示， Givosiran 在 2.5 mg/kg劑量下，經SC給藥能夠降低肝臟中ALAS1的水平，同時尿中 ALA 和 PBG 的水平也降低到了正常范圍。該結果與臨床前藥效學研究結果具有較好的相關性，從側面提示了非臨床藥效學研究對于提示臨床試驗設計的重要性。肝臟毒性是非臨床和臨床對應關聯(lián)的毒性表現，可在臨床階段進行密切監(jiān)控，全面評估藥物的安全性和風險：非臨床結果顯示肝細胞單細胞壞死、肝細胞嗜堿性顆粒等；臨床中也有一定肝毒性結果。
對于寡核苷酸藥物，非臨床研究中發(fā)現的毒性與臨床試驗中出現的 AE 具有較高的關聯(lián)性。Givosiran 非臨床結果顯示肝細胞單細胞壞死、肝細胞嗜堿性顆粒等，臨床中則可見轉氨酶升高和肝臟毒性，并在說明書中給予警示。上述關聯(lián)性提示，非臨床研究對于評估臨床安全性和指導風險控制計劃的制定具有重要價值。
綜上所述，非臨床研究為臨床試驗設計提供了依據；科學的劑量和給藥方案探索、無縫銜接的臨床研究規(guī)劃、合理的III期臨床試驗設計是 Givosiran 快速獲得監(jiān)管機構上市批準的重要保障。此外，基于穩(wěn)健的前期數據，與監(jiān)管機構進行有效的溝通也是必不可少的藥政策略。Givosiran 的上市歷程和臨床開發(fā)路徑的復盤分析為 siRNA 藥物的研發(fā)提供了寶貴的經驗和啟示。
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