慢性疼痛是指持續(xù)一個(gè)月以上的疼痛，骨關(guān)節(jié)炎、頸痛、腰痛、頭痛、癌痛等均是常見(jiàn)的慢性疼痛。目前，我國(guó)至少有一億以上的慢性疼痛患者。由于它的發(fā)作給患者帶來(lái)的痛楚，會(huì)使人出現(xiàn)睡眠紊亂、缺乏食欲、精神崩潰等后果，這嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，因此也有人把慢性疼痛比喻為一種不死的癌癥。目前治療慢性疼痛的主要方法是服用阿片類(lèi)藥物（如嗎啡、杜冷丁），但是阿片類(lèi)藥物具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，長(zhǎng)期服用會(huì)導(dǎo)致耐受和依賴(lài)。

已有研究表明，電壓門(mén)控鈉離子通道（Nav）與疼痛感覺(jué)的發(fā)生相關(guān)，而且Nav1.7可能在慢性疼痛中起中心作用。因此葛蘭素史克（GSK）、輝瑞（Pfizer）、渤?。˙iogen）和基因泰克（Genentech）等公司一直在嘗試使用小分子藥物和抗體來(lái)阻斷Nav1.7，但這些療法會(huì)與體內(nèi)結(jié)構(gòu)相似的其他鈉通道相互作用，產(chǎn)生麻木等不良的副作用，均未取得成功。

2021年3月10日，加利福尼亞大學(xué)圣地亞哥分校發(fā)表在《Science Translational Medicine》雜志上題為“Long-lasting analgesia via targeted in situ repression of NaV1.7 in mice”的研究，利用dCas9蛋白和鋅指蛋白靶向定位Nav1.7，阻止Nav1.7基因的表達(dá)，從而緩解小鼠慢性疼痛。

為了開(kāi)發(fā)一款持久且非成癮性緩解慢性疼痛的產(chǎn)品，研究人員探索了兩種獨(dú)立的遺傳學(xué)方法來(lái)抑制疼痛在脊柱水平的傳播。一種是使用dCas9蛋白（不會(huì)產(chǎn)生切割，只會(huì)在sgRNA的引導(dǎo)下特異性的結(jié)合目的位點(diǎn)）實(shí)現(xiàn)對(duì)NaV1.7的非永久性基因抑制。另一種是使用ZFP鋅指蛋白（識(shí)別并修飾特定DNA序列）進(jìn)行表觀遺傳調(diào)控NaV1.7的表達(dá)。并將兩種蛋白包裝在腺相關(guān)病毒（AAV）中，穿梭進(jìn)細(xì)胞中。

接下來(lái)，研究人員探究了在三種常見(jiàn)疼痛模型中兩種抑制NaV1.7表達(dá)方法的表現(xiàn)。

首先是卡拉膠誘發(fā)的炎性疼痛模型，在小鼠施加卡拉膠24小時(shí)后，提取DRG，并通過(guò)qPCR確定NaV1.7轉(zhuǎn)錄表達(dá)的抑制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射AAV9-Zinc-Finger-4-KRAB的小鼠NaV1.7抑制率達(dá)67％，注射AAV9-KRAB-dCas9-dual-gRNA的小鼠NaV1.7抑制率達(dá)50％，而且還觀察到注射AAV9-Zinc-Finger-4-KRAB和AAV9-KRAB-dCas9-dual-gRNA的小鼠中縮爪反應(yīng)潛伏期（PWL）顯著增加。這說(shuō)明小鼠NaV1.7的靶向抑制可以降低炎性疼痛狀態(tài)下的熱痛覺(jué)過(guò)敏。

第二種模型是化療法中紫杉醇產(chǎn)生的多發(fā)性神經(jīng)性疼痛，在第14、16、18和20天對(duì)小鼠腹膜內(nèi)給予8 mg / kg紫杉醇，然后測(cè)試小鼠的觸覺(jué)異常性疼痛閾值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和AAV9-KRAB-dCas9-no-gRNA的小鼠的閾值降低，而AAV9-Zinc-Finger-4-KRAB和、AAV9-KRAB- dCas9-dual-gRNA的閾值增加。這表明原位抑制NaV1.7可預(yù)防化療引起的觸覺(jué)異常性疼痛。

第三種模型是BzATP（ATP類(lèi)似物）誘導(dǎo)的持續(xù)性疼痛，在小鼠鞘內(nèi)注射30 nmol BzATP后，測(cè)量0.5、1、2、3、6和24小時(shí)觸覺(jué)異常性疼痛閾值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射、AAV9-KRAB-dCas9-dual-gRNA的小鼠中，在30分鐘、1小時(shí)和3小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，觸覺(jué)異常性疼痛明顯減少。這說(shuō)明靶向抑制NaV1.7緩解BzATP誘導(dǎo)的持續(xù)性疼痛。

進(jìn)一步為了確定NaV1.7原位抑制對(duì)慢性疼痛是否長(zhǎng)期有效，研究人員在鞘內(nèi)注射AAV后第42、84和308天重復(fù)了卡拉膠炎性疼痛模型并測(cè)試了熱痛覺(jué)過(guò)敏，觀察到在所有三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，AAV9-Zinc-Finger-4-KRAB的小鼠PWL都有顯著改善，這說(shuō)明NaV1.7原位抑制對(duì)炎癥性疼痛具有持久性。

研究人員在AAV注射后105天和最后一次紫杉醇注射后85天測(cè)量了小鼠異常性疼痛閾值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與前期結(jié)果相比，對(duì)照組和AAV9-KRAB-dCas9-no-gRNA的小鼠在第105天時(shí)的觸覺(jué)異常性疼痛都比第21天增加了，而注射AAV9-Zinc-Finger-4-KRAB和AAV9-KRAB-dCas9-dual-gRNA的小鼠的閾值增加，這表明NaV1.7的原位阻遏對(duì)化療產(chǎn)生的疼痛具有長(zhǎng)期預(yù)防的作用。

最后，為了確定通過(guò)ZFP-KRAB和KRAB-dCas9抑制NaV1.7表觀遺傳的潛在副作用，研究人員進(jìn)行了一系列毒性和副作用測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不會(huì)影響小鼠的體重、體溫和肌肉張力。并研究了鋅指蛋白和CRISPR-dCas9介導(dǎo)的基因沉默對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的全基因組影響，確認(rèn)了靶向基因調(diào)控的CRISPR和鋅指方法均具有高度特異性。

總的來(lái)說(shuō)，這種療法在不關(guān)閉其他鈉通道的情況下敲低了Nav1.7的表達(dá)，小鼠除疼痛外沒(méi)有失去任何感覺(jué)，也沒(méi)有表現(xiàn)出其他副作用，這是研究慢性疼痛治療方法中又一里程碑式的發(fā)現(xiàn)。

參考資料：

[1]https://stm.sciencemag.org/content/13/584/eaay9056

[2]https://mp.weixin.qq.com/s/_lsXoFwTT75H-LXgCBE3nw

[3]https://www.nature.com/articles/d41586-021-00644-5