點(diǎn)評(píng) | 朱冰（中科院生物物理所）、何愛(ài)彬（北京大學(xué)）轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factor, TF）通過(guò)結(jié)合基因組調(diào)控元件（如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子），共同調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)決定、分化過(guò)程及應(yīng)激響應(yīng)?；虮磉_(dá)調(diào)控通常不是由單一TF獨(dú)立完成，而是多個(gè)TF按照特定的組合規(guī)則協(xié)同作用，其結(jié)合模式受染色質(zhì)可及性、核小體布局和表觀修飾等因素的動(dòng)態(tài)調(diào)控。系統(tǒng)解析多種TF的結(jié)合事件及其相互關(guān)系，對(duì)于理解基因調(diào)控的基本原理，并揭示其在發(fā)育與疾病發(fā)生中的功能機(jī)制具有重要意義。然而，受限于現(xiàn)有技術(shù)，傳統(tǒng)研究多聚焦于單一TF，難以全面刻畫(huà)多TF協(xié)同調(diào)控的全景圖?？贵w依賴(lài)的ChIP-seq和CUT&Tag等方法在通量和并行檢測(cè)能力方面存在限制；ATAC-seq和DNase-seq雖可用于推斷TF結(jié)合足跡（footprint），但在分辨率和單細(xì)胞適用性上仍顯不足。近年來(lái)發(fā)展出的SMF、SMAC-seq和Fiber-seq等基于DNA修飾酶的策略，雖可用于單分子檢測(cè)，但受限于酶的序列偏好性，且其修飾信號(hào)在擴(kuò)增中難以保留，需依賴(lài)三代測(cè)序直接讀取，不利于在單細(xì)胞層面的廣泛應(yīng)用。因此，如何在單細(xì)胞尺度高通量、準(zhǔn)確地獲取多種TF結(jié)合信息，仍是當(dāng)前基因調(diào)控與表觀遺傳研究面臨的核心技術(shù)挑戰(zhàn)之一。為突破這些技術(shù)瓶頸，同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院張家民教授、高紹榮教授、史偈君教授、劉曉雨教授多個(gè)課題組團(tuán)隊(duì)合作，在Protein & Cell發(fā)表了文章 Genome-Wide Investigation of Transcription Factor Footprints and Dynamics Using cFOOT-seq ，共同開(kāi)發(fā)了全新的 cFOOT-seq 技術(shù)。cFOOT-seq 基于高效、低序列偏好的雙鏈 DNA 脫氨酶 SsdAtox，可在全基因組范圍內(nèi)以單堿基分辨率同時(shí)檢測(cè)染色質(zhì)開(kāi)放性、核小體定位和轉(zhuǎn)錄因子足跡，并通過(guò)與 ATAC-seq 聯(lián)合，實(shí)現(xiàn)單分子乃至單細(xì)胞層面上定量地分析大量轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合占位信息，顯著突破了傳統(tǒng)方法在多靶點(diǎn)和靈敏度上的限制。核心創(chuàng)新：高效SsdAtox脫氨酶原位脫氨研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)比較 SsdAtox、Ddd_Ss 和 Ddd_Fa 的脫氨效率、序列偏好及 5mC 脫氨活性，最終選擇了表現(xiàn)最優(yōu)的 SsdAtox。cFOOT-seq 以SsdAtox為核心，可高效將開(kāi)放染色質(zhì)中的胞嘧啶（C）脫氨為尿嘧啶（U），并在擴(kuò)增測(cè)序后顯示為胸腺嘧啶（T），從而直接記錄 染色質(zhì)開(kāi)放性、核小體定位與 TF 足跡。憑借其高靈敏度與單堿基分辨率，cFOOT-seq 能在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)解析上百種 TF 的占位信息，適用于開(kāi)放區(qū)和非開(kāi)放區(qū)，并對(duì)低起始量樣本表現(xiàn)出卓越性能。cFOOT-seq 對(duì)染色質(zhì)可及性、核小體排布和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等多維度染色質(zhì)景觀信息的一體化檢測(cè)能力，使得研究者能夠在單次實(shí)驗(yàn)中全面檢測(cè)調(diào)控元件周?chē)娜旧|(zhì)環(huán)境與轉(zhuǎn)錄因子占位信息，從而更系統(tǒng)地解析基因調(diào)控的動(dòng)態(tài)邏輯。與ATAC-seq聯(lián)用進(jìn)行單分子及單細(xì)胞分析cFOOT-seq對(duì)TF足跡的檢測(cè)依賴(lài)于DNA脫氨而非DNA切割，保留了染色質(zhì)DNA完整性，因此cFOOT-seq可實(shí)現(xiàn)與其他組學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用。與ATAC-seq進(jìn)行聯(lián)合可形成ATAC-cFOOT-seq和cFOOT-ATAC-seq兩種方案，實(shí)現(xiàn)更低測(cè)序成本下的開(kāi)放染色質(zhì)TF占位分析。ATAC-cFOOT-seq在開(kāi)放區(qū)富集方面更突出，而cFOOT-ATAC-seq則具備更高檢測(cè)靈敏度?；陂_(kāi)放區(qū)的深度測(cè)序，該技術(shù)可定量分析單分子級(jí)TF足跡及TF協(xié)同作用；結(jié)合孔板建庫(kù)流程，scATAC-cFOOT-seq將其能力擴(kuò)展到單細(xì)胞水平，揭示復(fù)雜細(xì)胞群中的TF動(dòng)態(tài)。研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了FootTrack平臺(tái)，通過(guò)FOS（Footprint Occupancy Score）和TFOS（Transcription Factor Occupancy Score）指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)已知結(jié)合位點(diǎn)上TF占位強(qiáng)度的精確量化，并支持重頭（de novo）足跡預(yù)測(cè)，幫助發(fā)現(xiàn)新的TF結(jié)合模式與調(diào)控因子。解析轉(zhuǎn)錄因子的動(dòng)態(tài)變化利用cFOOT-seq，研究團(tuán)隊(duì)捕獲了不同細(xì)胞類(lèi)型的關(guān)鍵TF占位，深入解析了OSKM誘導(dǎo)重編程及SWI/SNF染色質(zhì)重塑因子抑制/恢復(fù)過(guò)程中的TF動(dòng)態(tài)變化。在 BRM014 處理的 HepG2 細(xì)胞中，對(duì)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子 TFOS 變化的分析實(shí)現(xiàn)了基于 SWI/SNF 依賴(lài)性的聚類(lèi)。具有相似 SWI/SNF 依賴(lài)性的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在基因組上呈更緊密的鄰近分布，提示了染色質(zhì)重塑與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的一種能量高效空間布局。憑借高靈敏度和單分子/單細(xì)胞分辨率，cFOOT-seq為高通量地解析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的時(shí)空動(dòng)態(tài)提供了強(qiáng)有力的工具。未來(lái)將該技術(shù)與高通量單細(xì)胞ATAC-seq及長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)結(jié)合，并借助多組學(xué)和機(jī)器學(xué)習(xí)算法，進(jìn)一步提升足跡預(yù)測(cè)的精度與廣度，可以推動(dòng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)入新階段。cFOOT-seq 將為繪制高精度基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、破解轉(zhuǎn)錄調(diào)控奧秘提供強(qiáng)大助力，并為揭示發(fā)育、再生及疾病背后的分子機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院博士研究生王姮、武昂和楊孟臣為論文共同第一作者。同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院張家民教授、高紹榮教授、史偈君教授與劉曉雨教授為論文共同通訊作者。
在理想的教科書(shū)模型中，我們往往看到一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子會(huì)靶向一個(gè)基因，激活其表達(dá)。然而，在體內(nèi)復(fù)雜的基因調(diào)控復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，往往有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控一個(gè)基因的表達(dá)，并且它們之間存在協(xié)調(diào)與競(jìng)爭(zhēng)，會(huì)受到染色質(zhì)環(huán)境的影響，并呈現(xiàn)高度的動(dòng)態(tài)性。傳統(tǒng)的組學(xué)技術(shù)手段難以在單次實(shí)驗(yàn)中同步獲取多種轉(zhuǎn)錄因子在單條DNA上的結(jié)合信息及其所處的染色質(zhì)環(huán)境，限制了我們對(duì)基因調(diào)控機(jī)制底層邏輯的深入理解。同濟(jì)大學(xué)張家民、高紹榮、史偈君和劉曉雨等課題組合作開(kāi)發(fā)出一種基于雙鏈DNA脫氨酶的轉(zhuǎn)錄因子足跡檢測(cè)技術(shù)——cFOOT-seq，這一技術(shù)與謝曉亮課題組發(fā)表的FOODIE技術(shù)異曲同工，為破解這一難題提供了新思路。該方法利用雙鏈DNA脫氨酶 SsdAtox，以單堿基分辨率將染色質(zhì)可及性、核小體排布及TF結(jié)合足跡同時(shí)“寫(xiě)入”DNA序列。相比傳統(tǒng)依賴(lài)抗體或酶切的方法，cFOOT-seq在通量、分辨率與靈敏度上實(shí)現(xiàn)了突破，可在一次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)上百種TF的結(jié)合信息。FootTrack分析平臺(tái)通過(guò)FOS和TFOS指標(biāo)實(shí)現(xiàn)TF結(jié)合強(qiáng)度的定量評(píng)估，并支持TF協(xié)同作用及其與染色質(zhì)狀態(tài)的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)合motif信息，該平臺(tái)還能實(shí)現(xiàn)de novo的TF占位預(yù)測(cè)，并追蹤其動(dòng)態(tài)變化。該技術(shù)在細(xì)胞重編程與染色質(zhì)重塑等模型中展現(xiàn)出了良好的動(dòng)態(tài)檢測(cè)能力。cFOOT-seq不破壞DNA完整性，具有良好兼容性。與ATAC-seq聯(lián)用后，可在更低測(cè)序深度下在單分子、單細(xì)胞分辨率，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的 TF 占位定量和協(xié)同作用分析。cFOOT-seq技術(shù)將染色質(zhì)可及性、核小體定位與TF結(jié)合統(tǒng)一于同一測(cè)序框架，構(gòu)建出全面、高精度的染色質(zhì)景觀圖譜。這一多維協(xié)同檢測(cè)能力，為解析轉(zhuǎn)錄因子的動(dòng)態(tài)行為及其與染色質(zhì)環(huán)境的相互作用、揭示基因調(diào)控“語(yǔ)法”和構(gòu)建精準(zhǔn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。基因表達(dá)調(diào)控是細(xì)胞命運(yùn)決定、發(fā)育程序執(zhí)行及應(yīng)激應(yīng)答的核心機(jī)制，而轉(zhuǎn)錄因子（TF）對(duì)特定順式元件的識(shí)別與結(jié)合是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在真實(shí)細(xì)胞環(huán)境中，TF常以協(xié)同方式發(fā)揮作用，其占位模式受到染色質(zhì)可及性、核小體布局與表觀修飾等多重因素的動(dòng)態(tài)調(diào)控。然而，受限于現(xiàn)有技術(shù)，我們長(zhǎng)期只能聚焦特定TF的結(jié)合狀態(tài)，難以全面解析多個(gè)TF協(xié)同調(diào)控的動(dòng)態(tài)圖譜。如何在全基因組尺度、以單分子甚至單細(xì)胞的精度，捕捉數(shù)百種轉(zhuǎn)錄因子的占位信息，是表觀遺傳與基因調(diào)控領(lǐng)域長(zhǎng)期未解的重要難題。同濟(jì)大學(xué)張家民、高紹榮、史偈君和劉曉雨等課題組團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)發(fā)的cFOOT-seq技術(shù)為這一挑戰(zhàn)提供了創(chuàng)新解決方案。該研究開(kāi)發(fā)了cFOOT-seq，一種基于雙鏈DNA胞嘧啶脫氨酶 SsdAtox 的染色質(zhì)足跡檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了在基因組范圍內(nèi)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子占據(jù)位點(diǎn)、核小體定位和染色質(zhì)可及性的同步解析。與傳統(tǒng)ChIP-seq或ATAC-seq等方法相比，cFOOT-seq具備無(wú)需抗體、無(wú)需切割DNA、能在開(kāi)放與閉合染色質(zhì)中均可檢測(cè)TF占據(jù)的顯著優(yōu)勢(shì)，尤其適用于低細(xì)胞數(shù)、單分子乃至單細(xì)胞分辨率的研究。1. 全新酶學(xué)機(jī)制與定量邏輯：通過(guò)胞嘧啶脫氨酶將開(kāi)放染色質(zhì)中的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，以序列轉(zhuǎn)換為媒介記錄染色質(zhì)結(jié)構(gòu)信息；2. FootTrack 分析框架：配套開(kāi)發(fā)的算法平臺(tái)能從已知或de novo預(yù)測(cè)的motif出發(fā)，定量追蹤TF占據(jù)動(dòng)態(tài)；3. 單分子與單細(xì)胞解析能力：結(jié)合ATAC-seq進(jìn)行開(kāi)放染色質(zhì)富集，cFOOT-seq在單分子和單細(xì)胞層面成功解析TF足跡和共占據(jù)事件；
- 鑒定不同細(xì)胞類(lèi)型的TF特異性占據(jù)圖譜；
- 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)OSKM誘導(dǎo)重編程過(guò)程中的TF結(jié)合變化；
- 全面刻畫(huà)TF對(duì)SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物的依賴(lài)性；
- 揭示具有相似SWI/SNF依賴(lài)性的TF在染色質(zhì)上的空間組織規(guī)律。
綜上，該研究不僅提出了一種創(chuàng)新性強(qiáng)、適配性高的轉(zhuǎn)錄因子組學(xué)工具，也在轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變機(jī)制和染色質(zhì)重塑依賴(lài)性等多個(gè)維度提供了新的觀察窗口，將對(duì)表觀基因組學(xué)與功能基因調(diào)控研究產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。
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